Vďaka úžasnému technologickému vývoju vznikajú nové vedné odbory. Jedným z nich je aj bioinformatika.
Práca typického mikrobiológa ešte do polovice minulého storočia spočívala v pestovaní baktérií na Petriho miskách v laboratóriu. Mikrobiológovia hľadali optimálnu kombináciu výživných látok v kultivačnom agare, aby mohli popísať životné nároky pre čo najviac bakteriálnych druhov. Ak išlo o baktériu nebezpečnú pre človeka, v rôznych podmienkach zisťovali, aké antibiotiká na ňu účinkujú. Ich obzor poznania siahal len po baktérie, ktoré im na Petriho miskách vyrástli. V roku 1969 však americkí vedci objavili dovtedy neznámu baktériu žijúcu v horúcom prameni v Yellowstonskom národnom parku. Tento prameň mal teplotu vyššiu než 90 °C, čo je teplota, pri ktorej sa taví už aj agar na Petriho miske. Vtedy si vedci uvedomili, že určite existujú aj také baktérie, ktoré pestovať v laboratóriu nikdy nebude možné. Ako však študovať ich nároky na živiny, ich životný cyklus, ich schopnosti a toxicitu pre ľudí bez pestovania na Petriho miskách? Vyriešil to až vynález DNA sekvenátora.
Sekvenovanie
Vedci najprv osekvenovali genóm baktérie Haemophilus influenzae, ktorá spôsobuje zápal pľúc. Použili na to jednu bakteriálnu kolóniu, ktorá im vyrástla na Petriho miske. Jedna kolónia obsahuje niekoľko tisíc identických kópií jednej bakteriálnej bunky.
DNA izolovanú z týchto buniek vložili do sekvenátora a získali sekvenciu kompletného genómu Haemophilus influenzae. Keďže sa Haemophilus pestuje v laboratóriu veľmi jednoducho a všetky jeho vlastnosti už boli dobre známe, vedci vedeli k sekvenciám jeho génov priradiť ich funkciu. Potom sa pustili do sekvenovania genómov ďalších ľahko pestovateľných baktérií. Tak vytvorili jednu veľkú databázu, ktorá v súčasnosti obsahuje niekoľko desiatok tisíc buď kompletných, alebo čiastočne osekvenovaných genómov baktérií. Vedci začali odoberať environmentálne vzorky z rôznych miest – z jazier, horúcich prameňov, ľadu v Antarktíde, rôznych častí ľudského tela… Najväčšie prekvapenie nastalo, keď vyseparovali baktérie z ľudského výkalu a osekvenovali ich DNA bez predpestovania na Petriho miskách. Porovnali získané sekvencie so spomínanou obrovskou databázou genómov všetkých ľahko pestovateľných baktérií a výsledok bol, že viac než 60 % baktérií z ľudského výkalu bolo dovtedy úplne neznámych!
Počítač – najbližší pomocník
Pred nástupom sekvenovania DNA si vedci mysleli, že najrozšírenejšou baktériou v našom tráviacom trakte je Escherichia coli. Keďže táto baktéria nepotrebuje na svoj rast nijaké zvláštne výživné látky, uchytila sa na Petriho miskách ako prvá. Ostatné, náročnejšie baktérie, na miskách vôbec nevyrástli.
Až sekvenovanie DNA ukázalo, že pestovanie na Petriho miskách zloženie ľudského mikrobiómu veľmi skresľuje. Vysvitlo, že v skutočnosti najrozšírenejšou baktériou v tráviacom trakte niektorých ľudí je Faecalibacterium, zatiaľ čo iných ľudí Bacteroides, Prevotella, Ruminococcus či Akkermansia. Sekvenovanie DNA ukázalo, že Escherichia coli tvorí menej než jedno percento z celého ľudského črevného mikrobiómu. Súčasní mikrobiológovia však už nechcú len napodobňovať prírodné prostredie v laboratóriu, ale chcú presne vedieť, ako to v prírode naozaj funguje. To všetko im prezradia DNA sekvencie baktérií. V súčasnosti mikrobiológ baktérie na agare v Petriho miskách takmer vôbec nepestuje. V laboratóriu je iba niekoľko dní, keď pripravuje environmentálnu vzorku na sekvenovanie. Väčšinu svojho času trávi pri počítači, kde spracúva milióny získaných sekvencií. Takto vznikol úplne nový vedný odbor – bioinformatika. Sekvenovanie DNA sa tak rozbehlo, že už existujú firmy, ktorým môžete poslať svoju vzorku výkalu a oni vám pošlú zoznam baktérií, ktoré obývajú váš tráviaci trakt – váš mikrobiálny profil. Naďalej však treba mať na pamäti, že väčšinu baktérií v našom tráviacom trakte ešte nepoznáme, a tak musíme byť s interpretáciou týchto výsledkov veľmi opatrní.
Gén 165
Sekvenovanie DNA je síce čoraz lacnejšie, ale environmentálne vzorky obsahujú toľko baktérií, že vedci si musia veľmi dobre premyslieť, ako využiť kapacitu sekvenátora čo najefektívnejšie.
Na identifikáciu baktérií sekvenujú iba ribozomálny gén 16S, pretože práve ten slúži ako občiansky preukaz každého bakteriálneho druhu. Zvyšok genómu neposkytuje až také rozlišovacie informácie. Gén 16S sa vyberie z genómu pomocou polymerázovej reťazovej reakcie, pre ktorú sa používa anglická skratka PCR (polymerase chain reaction). Počas tejto reakcie sa gén 16S namnoží niekoľko miliónov ráz – namnožený kúsok DNA sa volá amplikón. Pôvodná molekula DNA v bakteriálnej bunke, ktorá je dlhá niekoľko miliónov nukleotidov (písmen A, C, T, G), zostane iba v jednej kópii, čo je popri namnožených amplikónoch úplne zanedbateľné. Tým sa sekvenátor nebude zbytočne zaťažovať sekvenovaním ostatných génov z bakteriálneho genómu bez rozlišovacej schopnosti. Kvôli obmedzeným schopnostiam DNA sekvenátorov vedci pripravujú amplikóny iba z časti génu 16S, čo však ide na úkor presnosti. Neraz sa vo výsledku objaví napríklad aj nejaký bližšie neurčený druh rodu Clostridium. Problém je, že tento neurčený druh môže byť buď prospešná baktéria Clostridium butyricum, alebo nebezpečná baktéria Clostridium difficile. Môže to byť tiež úplne nový druh rodu Clostridium, ktorý ešte nikto nepopísal, lebo ešte nikdy nevyrástol na Petriho miskách. Sekvenovanie génu 16S teda vedcom napovie, že vo vzorke majú určité percento doposiaľ neznámych baktérií, ale nič viac sa o nich nedozvedia, pretože im chýba kompletná sekvencia ich genómu.
Pokračovanie článku si môžete prečítať v časopise Quark 4/2017.Časopis Quark si môžete objednať tu alebo na adrese: predplatne@quark.sk
Ing. Mária Džunková, PhD., Australian Centre for Ecogenomics, University of Queensland
Foto archív autorky, Fotky&Foto, Pixabay
